猪结肠脱细胞支架联合结肠癌细胞的体外共培养

0 引言 Introduction

结直肠癌是最常见的消化系统肿瘤之一，在中国该病的发病率也呈逐年上升趋势，目前治疗方案仍以外科手术为主，术后转移、复发、放化疗耐药性产生是导致治疗失败的主要原因。然而患者接受化疗药物治疗的有效率与机体对化疗药物的敏感性息息相关，但药物筛选的成功与否依赖于肿瘤模型的开发，肿瘤细胞的许多特性需要在特定环境中才能展现[1]。

目前广泛应用的细胞培养方法是二维培养，该培养方法操作简便、技术成熟、易于保存且成本较低，然而其无法提供细胞外基质等生长介质，也缺乏相应的离体基质，因此新型的三维肿瘤细胞培养方法不断被研究者探索并应用，如生物凝胶、3D 细胞克隆球培养、类器官等[2-6]，涉及领域涵盖了肿瘤的发生发展、血管拟态、侵袭转移及免疫逃逸等诸多方面。与传统二维培养相比，这类三维培养技术能提供给细胞一个更接近于体内微环境的生长空间，所以在临床前药敏试验和药物筛选实验中，利用三维细胞培养的方法能一定程度上代替动物体内实验，缩短临床前期试验周期，减少研究资金的浪费[7]。

脱细胞支架是一种通过化学、物理、生物等方法去除组织中的细胞成分仅保留细胞外基质的组织工程支架，由于去除了DNA 及表面抗原等细胞成分，且保留着组织的完整结构、细胞附着点和血管管道，具有无免疫原性或低免疫原性等特点。近年来脱细胞支架已被广泛用于各种肿瘤的研究，且取得了一定的进展和成果。脱细胞支架的空间排列、生物力学性质和生物相容性等特性均有助于还原肿瘤细胞生长的微环境[8]，同时脱细胞支架还能提供丰富的细胞因子[9]，能使肿瘤细胞表现出与在平面培养上不同的生物学形态[10]，有助于增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[11]，不少肿瘤细胞能在脱细胞模型培养条件下表现为更接近体内环境生长的肿瘤。

在大量的脱细胞组织研究中，结肠组织脱细胞方面的研究还停留在初步探索阶段，大部分仅从脱细胞的可行性、脱细胞结肠的组成特点方面进行探究。由于没有系统的细胞培养研究和证据，现在关于构建结肠脱细胞支架联合肿瘤细胞培养的可行性和意义尚待探究。脱细胞支架能提供天然的细胞外基质，细胞外基质不仅为细胞提供物理支撑，同时对其增殖、分化和存活也起到非常重要的作用。上皮性的结肠癌细胞系HCT116 具有很强的侵袭能力及很强的抗失巢凋亡能力[12-14]，更适合在脱细胞三维支架上培养。

由于猪和人类的基因组相似，猪与人的细胞外基质蛋白高度保守，表明猪结肠基质适合用于人类肿瘤模型的应用。此外，猪结肠很容易从市场上获取，价格低廉，能节约成本。因此，该实验探究了猪结肠脱细胞支架的基本表征，提供了HCT116 细胞在支架上生长的可行性证据，同时探究该支架与其他三维肿瘤模型(如水凝胶支架、三维肿瘤球模型、类器官等三维模型)的区别与优势，旨在为体外三维培养肠癌细胞的模型应用提供新的思路和方向。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外细胞观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年3 至9 月在南方医科大学基础医学院解剖实验室完成。

1.3 材料 获取市场上6 月龄长白猪的结肠，用冰盒保存运送至实验室备用。人结肠癌HCT116 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

实验用主要试剂和仪器：DMEM 高糖培养基、体积分数10%胎牛血清(Gibco)；十二烷基硫酸钠 SDS(Solarbio Life Science)；乙二胺四乙酸 EDTA、曲拉通 Triton X-100、Viability、Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live&Dead Cells(US EVERBRIGHT INC.)；苏木精-伊红染色试剂盒、DAPI 封固剂、TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽(Yeasen)；系统显微镜(型号：BX53，OLYMPUS)；扫描电子显微镜(型号：EVO MA，Carl Zeiss)；共聚焦显微镜(型号：TCS SPE Ⅱ，Leica)。

1.4 实验方法

1.4.1 脱细胞猪结肠支架的制备 将新鲜取下的猪结肠组织在流水中冲洗，并用镊子将结肠外的结缔组织、脂肪、淋巴结等钝性剥离后去除，反复用PBS 进行清洗。将处理好的猪结肠横断剪成长3.0-4.0 cm 的长条管状，把黏膜层向外翻，用2%SDS+0.5%EDTA 溶液浸泡，室温下摇床振荡12 h，每3 h 换液1 次。随后取出，用PBS 浸泡洗涤10-15 次，浸入1%Triton X100+0.5%EDTA 室温振荡12 h，每3 h 换液1 次。取出后用PBS 冲洗10-15 次，PBS 浸泡下4 ℃冰箱保存。

1.4.2 脱细胞猪结肠支架的组织形态学检测

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